Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

1.) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.

Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке. Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

2.) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

3.) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры:
ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);
ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);
ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);
незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга.

Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Реактивы

Можно использовать один из следующих красителей:

1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
2. Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
3. Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование

Микроскоп.

Ход определения

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Окраска ретикулоцитов на стекле

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин. Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим.

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II.

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I.

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Подсчет ретикулоцитов.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Фотографии ретикулоцитов:

Находят поля зрения, где эритроциты располагаются раздельно. В этих полях зрения необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Большая точность получается при подсчете на 2000 – 3000 эритроцитов.

В связи с тем, что в поле зрения располагается большое количество эритроцитов, что затрудняет подсчет, необходимо ограничить (уменьшить) поле зрения. Для этого можно воспользоваться либо специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров, либо воспользоваться специальным «окошком» (из бумаги вырезают круг диаметром несколько меньше окуляра, в центре круга вырезают небольшой ромбик и вставляют полученное окошко в окуляр).

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Пример: При подсчете в мазке 1000 эритроцитов выявлено, что 15 эритроцитов из 1000 имеют зернисто-сетчатую субстанцию той или иной степени, то есть являются ретикулоцитами. Следовательно, количество ретикулоцитов в данном случае составляет 1,5% или 15‰.

Литература:

• Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под редакцией Меньшикова В. В. - Москва, "Медицина", 1987 г
• Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы - "Клинические лабораторные исследования" - Москва, "Медицина", 1984 г.

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Предметные стекла.
2. Шлифованные предметные стекла.
3. Влажная камера.
4. Смесители для белых и красных кровяных телец.
5. Стекла с луночкой.
6. Микроскоп.
7. Бриллианткрезиловая синька.
8. Абсолютный этиловый спирт.
9. Метиловый спирт или смесь Никифорова (равные части этилового 96° спирта и эфира).
10. Реактив Гайема или 3% раствор поваренной соли.
11. Иммерсионное масло.
12. Набор инструментов для укола в палец.

В зависимости от строения зернисто-сетчатой субстанции различают пять видов ретикулоцитов: пылевидный, венчикообразный, неполносетчатый, полносетчатый и клубкообразный (см. рис).

Взятие крови с целью подсчета в ней ретикулоцитов производят по указанию врача. Чтобы подсчитать количество ретикулоцитов, их окрашивают. С этой целью используют:

1. Способ прижизненной (суправитальной) окраски ретикулоцитов.
2. Способ одновременной суправитальной окраски тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву.

Рассмотрим данные способы более подробно.

Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

1. Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
2. Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
3. Азур I.

Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови. Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором). Ретикулоциты подсчитывают точно так же, как , с ограничителем поля зрения. Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой, бледно-зеленые с сеточкой голубого или синего цвета (см. рис.).

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву

Для этого способа применяют краску Алексеева. В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха. Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла. С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом. Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении на 15-30 минут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли. Из последующих капель готовят тонкие мазки. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течение 35-45 минут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.

1. Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.

2. Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.

3. Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В большинстве отечественных лабораторий подсчет ретикулоцитов производится в мазке после окраски их специальными красителями. Этот метод прост, экономичен, не требует наличия специального дорогостоящего оборудования, а потому может использоваться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Второй и третий методы подсчета ретикулоцитов также достаточно просты, но гораздо дороже с экономической точки зрения - требуют дорогостоящего оборудования (люминесцентный микроскоп и гематологический анализатор, проводящий подсчет ретикулоцитов) и реактивов, а потому могут использоваться лишь в некоторых лабораториях.

Определение количества ретикулоцитов производится при микроскопии специально окрашенных мазков.

Унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их бриллиантовым крезиловым синим, азуром I или азуром II непосредственно на стекле или в пробирке (1972).

Принцип. Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-нитчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей.

1.Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96 % в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.

2.Раствор азура I, предложенный П. Н. Кориковым: азур 1 - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид- 0.8 г, этиловый спирт 96 % 10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2-3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.

3.Раствор азура II следующего состава: азур II 1 г, натрия цитрат 5 г, натрия хлорид, 0,4 г, дистиллированная вода 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15- 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтрую). Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование. Микроскоп.

Ход определения.

Окраска на стекле.

Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3-4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий цвет.

Окраска в пробирке.

Метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1 % раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20-30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3: в пробирку помещают 0,3-0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку накрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1-2 часа (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 2-3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Подсчет ретикулоцитов.

В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в синий или синевато-фиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения. При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 10Х, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.

Принцип. Использование способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.

Реактивы.

1. Раствор акридинового оранжевого на изотоническом растворе хлорида натрия и концентрации 1:5000. Для приготовления изотонического раствора рекомендуют использовать дистиллированную воду pH 5,8-6,8, Раствор акридинового оранжевого должен быть свежим; хранят его не более 3-5 дней в темном флаконе с притертой пробкой.

2. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. ИМожно использовать афлуоль или обычное иммерсионное масло с флюоресценцией, погашенной нитробензолом (0,3 мл нитробензола на 1 мл масла). Ю. Н. Зубжицкий в качестве нефлюореспирующего масла предлагает использовать перегнанный анизол. Специальное оборудование. Микроскоп ультрафиолетовый МУФ-ЗМ или люминесцентный.

Ход определения. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 ч). Смесь перемешивают в течение 2 мин, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-нитчатая субстанция светится ярко-красным цветом. Замечено, что в крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. Метод отличается простотой и требует немного времени; благодаря яркому свечению ретикулоциты легко подсчитать. Нормальные величины. У здоровых число ретикулоцитов составляет 2 -12 промиле, или 0,2-1,2 %.

Клиническое значение.

Число ретикулоцитов в крови отражает регенеративные свойства костного мозга, и оценка его широко используется при различных анемиях (см. табл. 24). Повышение количества ретпкулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях, особенно в период криза (количество ретикулоцитов может быть 20 -30 %), а также на фоне лечения анемии Аддисона Бирмера витамином В12 (ретикулоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4-8-й день лечения). Снижение количества ретикулоцитов характерно для гипопластической анемии, рецидива анемии Аддисона-Бирмера. Определение количества ретикулоцитов может быть использовано для определения продукции эритропоэза и вычисления срока жизни эритроцитов.

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ОБМЕНА ЖЕЛЕЗА (ТРАНСПОРТ И ДЕПОНИРОВАНИЕ).

Транспорт железа

Трансферрин

• Транспортный белок (b-1-глобулин), гликопротеин,
• Переносит Fe из ЖКТ к эритрокариоцитам и в тканевые депо (печень и др.).
• Нормальный уровень: 2,6±0,05 г/л.
• Насыщение трансферрина железом: 30-75%.
• Поступает в клетку путем эндоцитоза: захват клеткой комплекса Fe-трансферрин.

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при окраске бриллиант-крезиловым синим без предварительной фиксации.

Реактивы:

1 % раствор бриллиант-крезилового синего: 50 мг краски растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 20 мг цитрата натрия (раствор хранят в посуде из темного стекла, годен в течение нескольких дней).

Методика:

На предметное стекло с лункой наносят 2 капли 1 % раствора краски бриллиантового крезилового синего и 1 каплю крови. Осторожно перемешивают стеклянной палочкой и смесь помещают во влажную камеру (чашку Петри, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты) на 30 минут при комнатной температуре. Затем делают мазки и высушивают.

Подсчет ретикулоцитов:

В мазках эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленый цвет, а зернисто-сетчатая субстанция в ретикулоцитах - в синий и фиолетовый цвет.

Мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Подсчет ретикулоцитов производят на 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете 2000-3000 эритроцитов).

Увеличение числа ретикулоцитов наблюдается при:

стимуляции эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, ретикулоцитарный криз при успешном лечении В12-дефицитной анемии, острый недостаток кислорода).

Уменьшение числа ретикулоцитов наблюдается при:

угнетении эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, нелеченные В12-дефицитные анемии, метастазы рака в кости),

заболеваниях почек, эндокринных заболеваниях.

Увеличение ретикулоцитов их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается: при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах); при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом); при малярии; при полицитемии; при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии); при остром недостатке кислорода; при метастазах опухолей в костный мозг. Следует помнить, что в случае усиленного разрушения эритроцитов доля ретикулоцитов может превышать 50% вследствие искусственного завышения числа ретикулоцитов (как уже было отмечено ранее, доля ретикулоцитов рассчитывается в % от всех эритроцитов). В таких случаях ля оценки тяжести анемий используют «ретикулярный индекс», который рассчитывают по формуле: (% ретикулоцитов х гематокрит) / 45 х 1,85, где 45 – нормальный гематокрит, 1,85- количество суток, необходимых для поступления новых ретикулоцитов в кровь. Если индекс

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями. Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории. Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке. Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I). (2) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии. Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям. Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла. Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. (3) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора. В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются. Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры: ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией); ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией); ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией); незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга. Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.

studfiles.net

Ретикулоциты (reticulocytus)

Ретикулоциты - это молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер.

Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие зернисто-сетчатой субстанции, которая проявляется при суправитальной окраске, т. е. без предварительной фиксации клеток.

Электронно-микроскопически показано, что зернисто-сетчатые структуры представляют собой остатки эндоплазматической сети, рибосом и митохондрий, содержащие РНК. В ретикулоцитах в незначительной степени осуществляется синтез белка (глобина), гема, пуринов, пиримидиннуклеотидов, фосфатидов, липидов, однако РНК в них не синтезируется. В течение 2 дней ретикулоцит остается в кровеносном русле, после чего по мере уменьшения РНК становится зрелым эритроцитом.

В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т.е. окрашены разными красителями.

В настоящее время используется унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их

• бриллиантовым крезиловым синим,
• азуром I или
• азуром II непосредственно на стекле или в пробирке.

1. Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции эритроцитов при окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

2. Реактивы:

а) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96% в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса): 1,2 г краски на 100 мл спирта;

б) раствор азура I: азур I - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид - 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в тер- мостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать;

в) раствор азура II: азур II - 1 г, натрия цитрат - 5 г, натрия хлорид - 0,4 г, дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

3. Окраска

Окраска на стекле:

• хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте;
• на приготовленные подобным образом стекла наносят каплю крови, делают тонкий мазок и сейчас же помещают стекло во влажную камеру. Для этого используют чашку Петри с крышкой, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты;
• во влажной камере мазки выдерживают 3–5 мин, а затем высушивают на воздухе. Зернисто-сетчатая субстанция ретикулоцитов окрашивается в фиолетово-синий цвет, четко выделяясь на зеленовато-голубоватом фоне эритроцитов.

Окраска в пробирке:

• метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 40 мкл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
• метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20– 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
• метод 3: в пробирку помещают 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5–6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1½ ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1½ ч –3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

4. Подсчет ретикулоцитов

В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий или синевато-фиолетовый цвет.

• Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом;
• необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения;
• практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр ×7, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

НОРМА: 0,5–1,2 % (30–70 × 109/л)

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается при:

• кровопотерях (особенно острой);
• гемолитических анемиях, особенно в период криза (до 20–30 %);
• на фоне лечения мегалобластной анемии витамином В12 (ретику- лоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4–8-й день лечения).

Понижение количества ретикулоцитов характерно для:

• апластических и гипопластических анемий;
• нелеченной мегалобластной анемии;
• лучевой болезни;
• приема цитостатических препаратов.

Жив ли Христос? Воскрес ли Христос из мертвых? Исследователи изучают факты

dyagnoz.ru

Ретикулоциты норма и подсчет их количества

Клетки крови ретикулоциты, норма которых различается в связи с множеством факторов, являются несформированными формами эритроцитов, а обнаружить их можно в составе костного мозга и периферической крови. Как правило, ретикулоциты в крови созревают за три-пять дней, а затем данные клетки превращаются в уже зрелые эритроциты. Причем количество несформированных эритроцитов у новорожденных младенцев существенно больше, чем у взрослых людей.

Выявление ретикулоцитов:

Выявляя ретикулоциты, норма которых определяется при помощи специальной таблицы, нужно учитывать их отличия от зрелых эритроцитов. В данной разновидности клеток крови либо содержится цельное ядро, либо его остатки наблюдаются в составе зернисто-нитчатой субстанции. Чтобы выявить количество таких клеток, необходимо изучить окраску мазка крови в лабораторных условиях. Для этого применяется синий бриллиантовый раствор, который наносится на обезжиренное и предварительно вымытое стекло, и уже затем делается мазок.

Когда выявляются ретикулоциты, норма которых различна, сразу после мазка используемое стекло следует поместить в чашку Петри – специальную влажную камеру, затем выдержать пять минут, тщательно высушить на свежем воздухе, а потом – микроскопировать. Причем субстанция зернисто-нитчатого типа внутри ретикулоцита обычно окрашивается в фиолетово-синий оттенок, а фон эритроцитов выделяется благодаря голубовато-зеленому оттенку.

Если применяется метод Гель-Мейера, окраску несозревших клеток крови можно разглядеть гораздо лучше, но для этого требуется пробирка Видаля. В данном сосуде пара капель крови смешивается с бриллиантовым раствором и хлоридом натрия, потом пробирка закрывается крышкой, а сам мазок выполняется уже через час.

Подсчет ретикулоцитов:

Рассчитывая количество несозревших клеток крови, нужно взять за основу 1000 эритроцитов, а затем рассмотреть ретикулоциты, норма которых обычно варьируется на уровне 0,2%-1,2% от количества взрослых эритроцитов. В среднем, у большинства людей число несозревших эритроцитов обычно составляет 0,7% от общего числа полностью созревших клеток крови. Если количество ретикулоцитов выше предельно допустимой нормы на 10% и больше, у человека возникает ретикулоцитоз – заболевание, сопровождающееся регулярными острыми кровотечениями и гемолитическими анемиями.

Подсчитывая ретикулоциты (норма у детей обычно высокая), стоит смотреть, чтобы их число не превысило предельные значения, характерные для взрослых. Нормативы зависят и от пола, поскольку у женщин 2,07% незрелых эритроцитов еще считается допустимым параметром, а у мужчин данный показатель не должен превышать 1,92%.

В случаях, когда уровень ретикулоцитов существенно повышен, это свидетельствует о наличии таких нарушений в организме, как малярия и талассемия, полицитемия и гипоксия, анемия, всевозможные гемолитические синдромы, но такие показатели возможны и при лечении цианкобаламином. Если уровень незрелых эритроцитов понижен, у человека может наблюдаться апластическая и гипопластическая анемия, всевозможные заболевания почек и микседема, а также распространение на кости метастазов опухолей.

Чтобы диагностировать тяжесть анемии, необходим расчет «ретикулоцитарного индекса», который рассчитывается как соотношение процента ретикулоцитов и нормальных значений гематокрита, помноженных на число суток, необходимых для поступления несозревших клеток в периферическую кровь. Если полученный индекс не превышает двойки, показатель свидетельствует о гипопролиферативном компоненте анемии, в а случае превышения двойки – показывает вероятность повышенного образования эритроцитов.

fb.ru

Исследование крови. Анализ крови

Определение концентрации гемоглобина

Среди методов определения гемоглобина наиболее широкое распространение получили методы, основанные на колориметрии, т. е. определении интенсивности окраски.Наиболее простым из них является определение гемоглобина при помощи визуальной колориметрии в гемометре Сали, который представляет собой деревянный штатив с центральной градуированной пробиркой, по бокам которой расположены запаянные стеклянные трубочки с цветным стандартом (солянокислый гематин в глицерине).В центральную пробирку предварительно наливают 0,1% раствор соляной кислоты до метки, соответствующей 2 или 3 г%, затем осторожно вносят (точно!) 0,02 мл крови, взятой из пальца специальной пипеткой, приложенной к гемометру. Поверхностным слоем кислоты промывают пипетку и, перемешав стеклянной палочкой кровь и кислоту, оставляют на 5 мин для образования солянокислого гематина. Затем добавляя дистиллированную воду и постоянно перемешивая палочкой, добиваются полного совпадения цвета жидкости в центральной пробирке со стандартами. Концентрация гемоглобина соответствует отметке уровня раствора по нижнему мениску. Концентрацию гемоглобина можно выражать или в г% гемоглобина или в условных единицах. 16,67 г гемоглобина принято за 100 единиц.

Концентрация гемоглобина в крови у женщин бывает от 11,7 до 15,8 г°/о или от 117 до 158 г/л,-у мужчин - от 13,3 до 18 г% или от 133 до 180 г/л.

Взятие крови для подсчета форменных элементов

Для подсчета форменных элементов кровь разводят в смесителях (меланжерах) или пробирках, что последнее время получило более широкое применение.Для подсчета эритроцитов кровь разводят в 200 раз 3% раствором хлорида натрия; если для взятия крови мы пользуемся пипеткой от гемометра, объем которой 0,02 мл, то мы должны брать 4 мл раствора хлорида натрия.Для подсчета лейкоцитов кровь разводят в 20 раз, следовательно берут 0,02 мл крови и 0,38 мл 3% подкрашенного раствора метиленовой синькой уксусной кислоты, которая необходима, чтобы вызвать разрушение эритроцитов.Взятие крови должно производиться с большой точностью, так как при таких небольших объемах попадание пузырька воздуха или остатка крови на внешней стороне пипетки ведет к увеличению ошибки определения.Перед заполнением камеры необходимо протереть в камере шлифованное стекло так, чтобы появились радужные кольца.Перед заполнением камеры разведенную кровь тщательно перемешивают, так как клетки оседают на стенки пробирки или ампулы смесителя, после этого каплю крови вносят под притертое шлифованное стекло камеры и оставляют на 1 мин в покое для оседания клеток.

Подсчет форменных элементов производят при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х, окуляр 15Х или 10Х) в затемненном поле зрения.

Эритроциты считают в 5 больших квадратах (16x5 = 80 малых квадратов), расположенных в разных участках камеры, можно брать квадраты, расположенные по диагонали.Счету подлежат эритроциты, лежащие внутри квадрата, и те, которые находятся на верхней и левой его сторонах; эритроциты, лежащие на нижней и правой сторонах, не считают, так как они относятся уже к другим квадратам.

Подсчитав число эритроцитов (А) в 5 больших квадратах, находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном малом квадрате A/80, т. е. в 1/4000 мкл. Поэтому, чтобы найти число эритроцитов в 1 мкл, мы должны умножить полученное от деления число на 4000 и на 200 (разведение) .

Таким образом, мы получаем следующую формулу:

X=A*4000*200/80,

где X - число эритроцитов в 1 мкл, а А - число эритроцитов в 5 больших квадратах.Если мы считали эритроциты в 5 больших квадратах и разводили кровь в 200 раз, то общий множитель для числа А будет 10 000.

Нормальное содержание эритроцитов в крови женщин 4-5*106, мужчин - 4,5-5,5*106.

Лейкоциты считают в 100 больших квадратах, не разделенных на малые, что соответствует 1600 малым. Таким образом, число лейкоцитов, найденное в 100 квадратах, делят на 1600, умножают на 4000 и на 20 (разведение). В данном случае для получения результата достаточно число сосчитанных лейкоцитов умножить на 50. Нормальное содержание лейкоцитов в крови 5*103 - 8*103 в 1 мкл.

Цветовой показатель крови. Цветовым показателем крови называют число, которое показывает, каково в среднем насыщение гемоглобином отдельного эритроцита данной крови по сравнению с насыщением отдельного эритроцита нормальной крови.За нормальное содержание гемоглобина принимают 100 единиц, а нормальное количество эритроцитов равно 5 000 000.Величина цветового показателя здоровых людей колеблется от 0,9 до 1,1.Изучение мазка периферической крови. В мазках крови изучают морфологию эритроцитов и считают лейкоцитарную формулу, т. е. процентное соотношение между различными видами лейкоцитов.Для того чтобы исследование было успешным, приготовление, фиксация и окраска мазков крови должны проводиться с большой тщательностью.Для приготовления мазка поверхностью чистого, обезжиренного стекла на расстоянии 0,5 см от края предметного стекла прикасаются к капле крови у места прокола на пальце, а затем шлифованное покровное стекло помещают под углом 45° к предметному и подводят первое к капле крови так, чтобы она растекалась по заднему краю покровного стекла и легким движением, без резкого нажима делают мазок. Мазок должен кончаться на предметном стекле «метелочкой». Мазок высушивают на воздухе, при высыхании хороший, тонкий мазок имеет желтую окраску.

Простым, остро отточенным карандашом по середине мазка надписывают фамилию больного и дату исследования, после этого мазки фиксируют в метиловом спирте не менее 5 мин и красят по методу Романовского-Гимзы.

Краска состоит из смеси кислого (эозина) и основного (Азур II) красителей. Такой метод окраски дает возможность дифференцировать клетки. Первым этапом работы с мазком является оценка морфологии эритроцитов. Для этого выбирают тонкое место, где клетки лежат отдельно, а не в виде монетных столбиков. Нормальные эритроциты - безъядерные, окрашенные в розовый цвет клетки, округлые, приблизительно одинакового диаметра - 7,5 мкм, эритроциты имеют форму двояковогнутого диска, поэтому в мазке имеют просветление в центре и более интенсивно окрашенную периферию.

{module директ4}

Приготовление толстой капли

Для исследования крови на плазмодии малярии делают толстую каплю. Кровь берут обычным способом из мякоти пальца. К капле крови, выступившей из места укола, прикасаются поверхностью предметного стекла. Нанесенные отдельно 2-3 капли размазывают углом другого стекла. Сухой мазок заливают (без фиксирования) краской Романовского на 30-40 мин, потом окрашенную каплю осторожно ополаскивают водой и просушивают препарат в вертикальном положении.

Примерные данные анализа

Повышенное количество эритроцитов и гемоглобина в крови может быть при заболевании красных элементов крови - эритремии, тогда число эритроцитов достигает до 9-106 и больше.Увеличенное содержание эритроцитов в крови может возникнуть вторично, т. е. тогда, когда нет заболевания красного листка кроветворения, а количество эритроцитов повышается в результате болезни других органов и систем (при декомпенсированном диффузном пневмосклерозе, эмфиземе легких, некоторых видах врожденных пороков сердца, склерозе сосудов системы легочной артерии, пороках правого сердца, недостаточности кровообращения III степени и др.). Этот симптом называется эритроцитозом.

Морфологически измененные эритроциты появляются при гиперхромной (мегалобластической) анемии. При этом в крови находят крупные эритроциты с большим содержанием гемоглобина (макроциты), эмбриональные эритроциты (мегалобласты), которые обычно в периферической крови не встречаются. Морфология эритроцитов изменяется также и при гипохромной анемии: появляются малые эритроциты (микроциты), измененные по своей форме (пойкилоциты) и эритроциты с малым содержанием гемоглобина (гипохромные эритроциты).

Подсчет лейкоцитарной формулы

При подсчете лейкоцитарной формулы необходимо определение структурных особенностей цитоплазмы и ядер клеток. Принадлежность клетки к той или иной группе определяется на основании совокупности всех признаков цитоплазмы и ядра.При подсчете формулы надо придерживаться одного и того же способа передвижения стекла под микроскопом. Чаще всего применяется способ микроскопирования в 4 местах мазка. Известно, что лейкоциты распределяются в мазке неравномерно: лимфоцитов по краям меньше, чем в середине, а моноцитов в конце мазка больше, чем в начале. Поэтому при подсчете лейкоцитарной формулы лучше всего передвигаться по ломаной линии, просчитывая все встречающиеся клетки.Подсчет 200 клеток - практический минимум для обычных клинических исследований.Лейкоциты периферической крови в зависимости от наличия или отсутствия зернистости в цитоплазме делятся на гранулоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные) и агранулоциты (моноциты и лимфоциты).

Нейтрофилы. Размер клеток 10-12 мкм. Цитоплазма клеток бледно-розового цвета с мелкой, обильной, фиолетового цвета зернистостью. В норме в крови встречаются палочкоядерные (2-4%) и сегментоядерные (60-65%) нейтрофилы.

Эозинофилы. По величине клетки такие же, как нейтрофилы, иногда немного крупнее, цитоплазма заполнена крупными гранулами желтовато-красного цвета, ядро обычно имеет два сегмента одинаковой величины. Эозинофилов в норме 2-4%.Базофилы. По размеру это самый маленький гранулоцит. Ядро неправильной, многолопастной формы, занимает почти всю клетку, бледно-розовая цитоплазма содержит крупные темно-фиолетовые гранулы. Гранулы базофилов растворяются в воде, и иногда в результате смывания при окраске препарата на месте гранул остаются не смытые бесцветные ячейки. В норме базофилов 0,1%.Лимфоциты. Размер клеток колеблется от 7 до 10 мкм. Ядро компактной структуры, округлое или бобовидное. Цитоплазма клеток нежно-голубая с зоной просветления вокруг ядра (перинуклеарной), иногда в цитоплазме встречаются отдельные азурофильные зерна красно-фиолетового цвета. В периферической крови в норме 20-35% лимфоцитов.Моноциты. Размер клеток колеблется от 12 до 20 мкм. Ядро чаще подковообразной, иногда неправильной формы. Цитоплазма более обширна чем у лимфоцитов, пепельно-голубого цвета с мелкой, нежной, красноватой зернистостью.Моноцитов в норме 6-8%.

Повышенное содержание в крови лейкоцитов называется - лейкоцитозом, а пониженное - лейкопенией.

Окраска и подсчет ретикулоцитов

Ретикулоциты представляют собой молодые эритроциты с тонкой синей сетчаткой или зернистостью в цитоплазме. Эти клетки характеризуют активность красного кроветворения.Для выявления подсчета ретикулоцитов пользуются методом суправитальной (прижизненной) окраски. На предметных стеклах делаются мазки краски бриллианткрезилблау в абсолютном спирте, а затем на покрытом краской стекле делают обычным образом мазок крови и помещают его на 3-5 минут во влажную камеру, после чего сушат и микроскопируют с иммерсионным объективом. В норме на 1000 эритроцитов встречается 8-10 ретикулоцитов, число их принято выражать в процентах (0,8-1%) или в промиллях (8-10%о) по отношению к эритроцитам.Ретикулоциты - клетки, которые характеризуют повышенную выработку эритроцитов в костном мозге.

Они в большом проценте появляются в периферической крови при гипохромной анемии («злокачественной анемии»), при гемолитической анемии и др. заболеваниях. Пониженное содержание ретикулоцитов и полное их исчезновение в периферической крови наблюдаются при обострении гиперхромной анемии.

Для предупреждения агрегации (склеивания) кровяных пластинок прокол кожи делают через каплю 14% раствора сернокислой магнезии, нанесенной на палец. Кровь смешивают с магнезией и готовят тонкие мазки на предметных стеклах, которые затем фиксируют и окрашивают по Романовскому в течение 2-х часов.Определяют количество кровяных пластинок на 1000 эритроцитов, а зная число эритроцитов в 1 мкл, подсчитывают число тромбоцитов в 1 мкл крови. В норме тромбоцитов содержится от 250 000 до 400 000.

Определение СОЭ

Скорость оседания эритроцитов определяется в крови, смешанной в соотношении 4:1с лимоннокислым натрием.Реакция ставится в аппарате Панченкова. Капилляр Панченкова промывают цитратом натрия, затем набирают цитрат до метки 50, где стоит буква Р (реактив) и выдувают его в видалевскую пробирку. Этим же капилляром берут кровь дважды до метки К (кровь) и смешивают ее с цитратом. Смешанной с цитратом кровью заполняют этот же капилляр до деления 0 и ставят вертикально в штатив на час. Через час отмечают в миллиметрах величину столбика плазмы, образовавшегося над осевшими эритроцитами, что и является мерой скорости оседания эритроцитов.В норме СОЭ у мужчин равна 10 мм/ч, у женщин-14 мм/ч.

Скорость оседания эритроцитов повышается при воспалительных, острых и хронических заболеваниях, при злокачественных опухолях и других заболеваниях.

Проба на совместимость резус-фактора

В пробирку без цитрата берут 2-3 мл крови реципиента, после свертывания крови сгусток обводят стеклянной палочкой и кровь центрифугируют. Две капли сыворотки из этой пробирки наносят на чашку Петри, добавляют к ней полкапли крови донора, перемешивают и чашку помещают в водяную баню (42-45°). Через 10 мин чашку вынимают и просматривают на свету при легком покачивании. Появление агглютинации укажет на недопустимость переливания данной крови.