В настоящем сообщении представлены результаты определения антител к ВИЧ в сыворотке крови 40 823 человек, в число которых входили пациенты женских консультаций, поликлиник, больниц города, а также медицинских центров, специализирующихся на обследовании и лечении больных групп риска (наркоманы, пациенты с вирусными гепатитами В, С и венерическими заболеваниями). Исследования были проведены в 2005 году в лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, обладающей более чем 15-лет-ним опытом применения методов ИФА для диагностики различных инфекционных заболеваний.
Для первичного обследования образцов сыворотки крови использовали тест-систему “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск), выявляющую в обследуемых образцах сыворотки или плазмы крови человека суммарные специфические антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (иммуноглобулины классов A, G и M). В данном диагностическом наборе рекомбинантные белки ВИЧ применяются как для иммобилизации в лунки планшетов, так и в виде конъюгата с пероксидазой хрена. Оценку результатов анализа сывороток проводили в соответствии с рекомендациями инструкции к тест-системе: негативными (не содержащими антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2) считали тестируемые пробы, оптическая плотность (ОП) которых в ИФА не превышала значение ОПкрит.
При проведении скрининга в лаборатории для 40222 (98,5%) из 40823 образцов сыворотки был получен отрицательный результат ИФА, а 601 (1,5%) исследованная проба была расценена как первично положительная. В результате проведенного на следующий день повторного анализа каждой из 601 сыворотки в дублях (двух лунках планшета) 440 (73,2%) образцов были определены как положительные, а 161 (26,8%) – как отрицательные. В соответствии с рекомендациями Министерства здравоохранения и социального развития 440 положительных в скрининге сывороток были заморожены и переданы для дополнительных подтверждающих исследований в консультационно-диагностический кабинет референс-лаборатории больницы № 30 им. С.П. Бот-кина. Эти исследования были проведены с использованием иммуноферментных тест-систем “ЭКОлаб-Вироностика ВИЧ 1,2 Аг/Ат” (“ЭКОлаб”, Электрогорск), “Genscreen Plus HIV Ag-Ab” (“БиоРад”, США), а также наборов для иммуноблота. Результаты анализа 440 сывороток в подтверждающих тестах позволили сделать заключение, что 323 (73,4 %) образца являются положительными, а 102 (23,2%) – отрицательными. Для 15 исследованных проб (3,4%) был получен неопределенный результат анализа.
Следует отметить, что значения ОП, полученные в нашей лаборатории при их первичном тестировании с использованием тест-системы “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2”, для 314 (97,2%) из этих 323 положительных сывороток составляли от 0,900 до 1,780, а для 9 (2,8%) образцов – 0,500–0,900. Величины ОП, полученные при скрининге 102 отрицательных сывороток, для 52 образцов (51%) находились в интервале от 0,195 до 0,400; для 40 (39,2%) проб – 0,401–0,800; 10 (9,8 %) образцов – более 0,800.
Таким образом, в результате проведенной работы показано, что первичное обследование сывороток крови на наличие серологических маркёров ВИЧ-инфекции с использованием тест-системы “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” является высокоэффективным. Положительные результаты скрининга подтвердились при проведении дополнительных исследований в референс-лаборатории в 73% случаев, а ложноположительные – зарегистрированы только для 0,25% из 40 823 проанализированных сывороток.
Наибольшее распространение сегодня в мире получил СПИД - вирус из подсемейства ретровирусов, их называют еще лентивирусами, или «медленными». Действительно, в организме человека они начинают проявлять активность по прошествии сравнительно длительного времени, приблизительно лет через 10.
Существует иммунодефицит первого и второго типа. Но смело можно говорить об экспансии вируса первого типа. Попав в кровь и присоединившись к клетке, которая отвечает за иммунитет, вирус начинает быстро размножаться. Пока молекула СD4, отвечающая за его распознание, идентифицирует коварного врага, он успевает заразить весь организм. Поэтому чем раньше его диагностировать, тем больше шансов у больного получить своевременное лечение и дольше прожить.
Если у человека есть повод проверить себя на СПИД, сделать это следует незамедлительно. Чаще всего основа такой диагностики - определение в крови антител к иммунодефициту - белков, возникающих как реакция на присутствие вируса, а начинают они образовываться в период от 1,5 до 6 месяцев со времени возможного заражения. Соответственно и пройти диагностику целесообразнее по истечении этого периода.
Определяется количество антител, используя анализ, получивший название иммуноферментного (ИФА). Этому методу доверяют, он сравнительно точный и высокочувствительный, эти показатели составляют свыше 99, 5%. Фармацевтический рынок предлагает ряд наборов диагностических тестов для ИФА: Комбибест ВИЧ, Анти-ВИЧ 1 2, КомбиБест анти-ВИЧ, КомбиБест анти - ВИЧ 1 2, КомбиБест анти-ВИЧ 1 2 d 0172. Эти тест-системы принадлежат к третьему поколению. Недостаток указанных реагентов: они не всегда выявляют болезнь в ранние сроки. Человек уже вирусоноситель, он потенциально опасен для партнеров, но антитела в крови еще не присутствуют.
Наборы в основном оснащены количеством тестов для проведения 12*8 или 192 анти - ВИЧ анализов. Самостоятельно пользоваться ими не рекомендуется. В описании препаратов указывается, что их главное предназначение - выявить количество антител к СПИДу обоих типов. А также определить антитела всех классов к СПИДу. Если антител нет, значит, болезнь не диагностирована.
Четвертое поколение тестов «видит», кроме антител, и антигены СПИДа, они способны обнаружить инфицирование раньше, чем средства третьего поколения. Для сравнения: антиген ВИЧ есть в крови, начиная уже с 5-х суток, а первые антитела появляются не ранее, чем через месяц. КомбиБест ВИЧ 1, 2 АГ/АТ (комплект 1) и КомбиБест ВИЧ 1, 2 АГ/АТ (комплект 2) принадлежат к тестам 4-го поколения. Воспользовавшись набором этих реагентов, выявляют антитела к типу 1, 2 и антиген р24 , исследуя сыворотку или плазму человеческой крови. Многие страны применяют ИФА тестирование именно 4 поколения, которое носит еще и название Антиген/Антитело, сокращенно - АГАТ.
Проводится тестирование анонимно.
Общая информация об исследовании
ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) – вирус семейства ретровирусов, который поражает клетки иммунной системы человека (CD4, Т-хелперы). Вызывает СПИД.
ВИЧ-1 – наиболее распространенный тип вируса, чаще всего встречающийся в России, США, Европе, Японии и Австралии (как правило, субтип В).
ВИЧ-2 – редкий тип, распространен в Западной Африке.
Для диагностики вируса иммунодефицита человека используется комбинированная тест-система четвертого поколения, способная определять ВИЧ-инфекцию уже через 2 недели после попадания вируса в кровь, тогда как тест-системы первого поколения делают это только через 6-12 недель с момента инфицирования.
Преимуществом этого комбинированного ВИЧ-анализа является выявление, благодаря использованию антител к ВИЧ-1 p24 в качестве реагентов, специфического антигена p24 (белка вирусного капсида), который может быть обнаружен данным тестом уже через 1-4 недели с момента инфицирования, т. е. еще до сероконверсии, что значительно сокращает "период окна".
Кроме того, такой анализ на ВИЧ выявляет в крови антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (с использованием реакции антиген-антитело), которые вырабатываются в достаточном количестве для определения тест-системой через 2-8 недель с момента заражения.
После сероконверсии антитела начинают связываться с антигеном p24, в результате чего тест на антитела к ВИЧ будет положительным, а тест на p24 – отрицательным. Однако спустя некоторое время в крови будут определяться и антитела, и антиген одновременно. На терминальной стадии СПИД-тест на антитела к ВИЧ может давать отрицательный результат, так как нарушается механизм выработки антител.
Стадии ВИЧ-инфекции
Несмотря на то что ВИЧ-инфекция неизлечима, сегодня существует высокоактивная антиретровирусная терапия (АРВТ), которая может значительно продлить жизнь ВИЧ-инфицированного и улучшить ее качество.
Данный тест имеет особенно высокую диагностическую ценность, если инфицирование ВИЧ произошло незадолго до момента тестирования (за 2-4 недели).
Для чего используется исследование?
Анализ используется для ранней диагностики ВИЧ, что позволяет предотвратить дальнейшую передачу вируса другим людям, а также своевременно начать антиретровирусную терапию и лечение заболеваний, способствующих прогрессированию ВИЧ-инфекции.
Когда назначается исследование?
ИФА (иммуноферментный анализ, ELISA – англ.) вошел в жизнь практической медицины еще где-то в 60-х прошлого столетия. Первоначальной его задачей были гистологические исследования в научных целях, которые сводились к поиску и идентификации антигенной структуры клеток живого организма.
В основе метода ИФА лежит взаимодействие специфических (АТ) и родственных антигенов (АГ) с образованием комплекса «антиген – антитело» , который выявляют при помощи фермента. Этот факт натолкнул ученых на мысль, что метод может быть использован в диагностических целях для выявления специфических иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе на ту или иную инфекцию. И это был прорыв в клинической лабораторной диагностике!
Активно использоваться метод начал только в начале 80-х и то, в основном, в специализированных учреждениях. Первыми иммуноферментными анализаторами были снабжены центры и станции переливания крови, инфекционные и венерологические стационары, поскольку рожденный на африканском континенте, появившийся на горизонте у нас и тут же примкнувший к «старым» инфекциям грозный СПИД, требовал незамедлительных мер диагностики и поиска лечебных препаратов, воздействующих на него.
Возможности иммуноферментного анализа поистине обширны. Теперь и представить себе трудно, как можно обойтись без подобных исследований, применяемых буквально во всех отраслях медицины. Кажется, что может сделать ИФА в онкологии? Оказывается, может. И многое. Способность анализа находить маркеры, свойственные некоторым видам злокачественных новообразований, лежит в основе раннего выявления опухоли, когда другим способом она еще не определяется из-за своих небольших размеров.
Современная клиническая лабораторная диагностика (КДЛ), кроме онкомаркеров, располагает значительным арсеналом панелей для ИФА и использует их для диагностики различных патологических состояний (инфекционных процессов, гормональных нарушений) и мониторинга фармацевтических лечебных препаратов с целью выявления их влияния на организм больного и, кстати, не только человека. В настоящее время иммуноферментный анализ широко используется и в ветеринарной службе, ведь «братья наши меньшие» тоже подвержены многим заболеваниям, от которых, порой, очень сильно страдают.
Таким образом, ИФА, благодаря своей чувствительности и специфичности, по образцу крови, взятому из вены, может определить:
Иммуноферментный метод, позволяет определить не только присутствие самого возбудителя (качественный анализ), но и его количественное содержание в сыворотке крови больного.
Вирусовая или бактериальная доза существенно влияет на течение инфекционного процесса и его исход, поэтому количественному анализу отведена не последняя роль в диагностике и лечении заболеваний в различных формах и стадиях.
Однако зная иммуноферментные исследования, как метод ИФА, мы даже не задумываемся, как же ему удается охватить такой широкий круг микроорганизмов, населяющих нашу планету, многие из которых несут прямую угрозу здоровью и жизни человека и животных. А дело в том, что ИФА имеет много вариантов (неконкурентный и конкурентный – прямой и непрямой), каждый из которых решает свою задачу и, таким образом, позволяет проводить целенаправленный поиск.
Для выявления иммуноглобулинов того или иного класса используется традиционная 96-луночная полистироловая панель (планшет), в лунках которой в твердой фазе сосредоточены сорбированные рекомбинантные белки. Попавшие в лунку с сывороткой крови антитела или антигены, находят «знакомый» объект и образуют с ним комплекс (АГ – АТ), который, закрепившись ферментным конъюгатом, при считывании результатов проявится изменением окраски лунки.
Иммуноферментный анализ проводится на тест-системах определенной специфичности, изготовленных в специальных лабораториях и укомплектованными всеми необходимыми реагирующими компонентами. Исследования можно проводить с помощью промывных аппаратов («вошеров») и считывающих спектрофотометров, где большей частью задействован ручной труд. На полных автоматах, освобождающих лаборанта от монотонного закапывания, промывания и прочих рутинных дел, конечно, работать быстрее и удобнее, но не все лаборатории могут позволить себе такую роскошь и продолжают работать по старинке – на полуавтоматах.
Интерпретация результатов ИФА находится в компетенции врача лабораторной диагностики, при этом обязательно берется в расчет и присущее практически всем иммунохимическим реакциям свойство давать ложноположительные или ложноотрицательные ответы.
Иммуноферментный анализ подходит для выявления всех форм , а, кроме этого, применяется в проведении скрининговых исследований. Для проведения анализа используют венозную кровь пациента, взятую натощак. В работе используются планшеты с определенной специфичностью (АТ классов А, М, G) или суммарные антитела.
Учитывая то, что АТ при сифилисе продуцируются в конкретной последовательности, ИФА может легко ответить на вопрос, когда произошло заражение и в какой стадии находится процесс, а расшифровка полученных результатов может быть представлена в следующем виде:
При проведении анализа на сифилис, лунки с отрицательным ответом (и отрицательный контроль) останутся бесцветными, в то время как положительный результат (как и положительный контроль) даст ярко-желтое окрашивание за счет изменения цвета хромогена, добавленного в ходе исследования. Однако интенсивность окраски не всегда совпадает с контролем, то есть, она может быть немного бледнее или слегка желтоватой. Это сомнительные результаты, которые, как правило, подлежат повторному исследованию с обязательным учетом количественных показателей, полученных на спектрофотометре, но в целом, окраска находится в прямо пропорциональной зависимости от количества иммунных комплексов (связанные между собой АГ и АТ).
Анализ на , пожалуй, больше других интересен широкому кругу населения, ведь пока нельзя с уверенностью утверждать, что исчезли многие социальные проблемы (проституция, наркомания и др.). К сожалению, ВИЧ затрагивает не только эти слои человеческого общества, заразиться можно при различных обстоятельствах, не связанных с половой распущенностью или приемом наркотиков. Но коль возникла необходимость обследования на ВИЧ, то бояться не следует, что все вокруг узнают о посещении такой лаборатории. Сейчас ВИЧ-инфицированные люди защищены законом, а сомневающиеся могут обратиться в анонимные кабинеты, где можно решить проблему, не боясь огласки и осуждения.
Иммуноферментный метод, применяемый для диагностики ВИЧ инфекции, относится к первостепенным стандартным исследованиям, которые, однако, требуют особых условий, поскольку тема очень деликатная.
ИФА на ВИЧ имеет смысл проводить после полового контакта, переливания крови, других медицинских манипуляций , предполагающих заражение, и по окончании инкубационного периода («серонегативное окно»), но следует учитывать, что этот промежуток времени не является постоянным. Он может закончиться через 14-30 дней, а может продолжаться до полугода, поэтому средним значением принято считать интервал от 45 до 90 дней. На ВИЧ кровь сдают так же, как и на другие инфекции – из вены на голодный желудок. Результаты будут готовы в зависимости от накопления материала в лаборатории и ее загруженности (от 2 до 10 дней), хотя чаще всего лаборатории обеспечивают получение ответа в тот же день или на следующий.
ИФА на ВИЧ-инфекцию определяет антитела к двум разновидностям вируса: ВИЧ-1 (более распространенный в России и других странах Европы и Азии) и ВИЧ-2 (встречающийся чаще на территории Западной Африки).
Задачей ИФА ВИЧ является поиск АТ класса G, которые выявляются на всех тест-системах, но в более позднем периоде, и АТ классов А и М, выявляемых на рекомбинантных тест-наборах нового поколения, позволяющих найти антитела на самых ранних стадиях (инкубационный период – «серонегативное окно»). От ИФА можно ожидать следующие варианты ответов:
Заключение о ВИЧ инфицировании выносится только на основании иммуноблотинга. Проводится беседа с инфицированным в условиях полной конфиденциальности. Разглашение медицинской тайны в России, как, впрочем, и в других странах, подлежит уголовному наказанию.
Анализы на хламидии и цитомегаловирус иммуноферментным методом также обрели особую популярность, ввиду того, что позволяют определить время заражения, стадию заболевания и эффективность лечебных мероприятий.
При внедрении тоже можно наблюдать появление антител различных классов в разных фазах патологического состояния, вызванного инфекционным агентом:
Что касается , то здесь несколько иначе: антитела класса М появляются приблизительно через месяц-полтора, то есть, положительным результат (IgM+) становится в фазе первичного инфицирования или при реактивации скрытой инфекции и остается таковым от 4 месяцев до полугода.
Наличие АТ класса G характерно для начала первичной острой инфекции или реинфекции. Анализ констатирует, что вирус имеет место, однако информации, в какой стадии находится инфекционный процесс – не дает. Между тем, определение нормы титра IgG тоже вызывает затруднения, так как она целиком зависит от иммунного статуса конкретного человека, который, впрочем, устанавливается выявлением иммуноглобулинов класса G. Учитывая такое поведение антител, при диагностике ЦМВИ возникает необходимость в оценке способностей антител класса G взаимодействовать с ЦМВ, чтобы потом «обезвредить» его (авидность АТ). На начальном этапе болезни IgG очень плохо связываются с антигенами вируса (низкая авидность) и лишь потом начинают проявлять активность, стало быть, можно говорить о повышении авидности антител.
О достоинствах иммуноферментного анализа можно говорить долго и много, ведь этот метод сумел решить многие диагностические задачи, используя лишь венозную кровь. Не нужно долгих ожиданий, волнений и проблем с забором материала для исследования. К тому же тест-системы для ИФА продолжают совершенствоваться и не за горами тот день, когда тест выдаст 100% достоверность результата.