Прямые способы

Микроскопия в темном поле

Бледные трепонемы не могут расти на питательных средах и не визуализируются под световым микроскопом. Так как обнаружение патогена с помощью обычной микроскопии невозможно, применяют специальный микроскоп с темным полем, где возбудитель виден в виде спирали на темном фоне.

Для проведения микроскопии забирается биоматериал с подозрительного на заболевание очага. Микроскопия в темном поле – это возможный способ оценки кожных поражений, таких как шанкр первичного сифилиса или кондилома вторичного сифилиса. Если материал макулопапулезного очага сухой, исследуют аспират лимфатического узла.

Отрицательный результат не исключает патологический процесс, статистически выявление возбудителя возможно только в 80%.

ПЦР-диагностика

Реакция, направленная на многократное увеличение ДНК бледной трепонемы, позволяет сделать вывод об инфицировании сифилисом или об его отсутствии.

Биоматериал для анализа может быть любым: кровь, содержимое сифилида, спинномозговой жидкости и пр. Тест подходит для инкубационного периода.

ПЦР полностью специфична.

Непрямые серологические анализы на сифилис: трепонемные и нетрепонемные тесты

Серологические анализы (КСР или комплекс серологических реакций) считаются наиболее распространенным способом для диагностики всех стадий сифилиса. Выделяют следующие реакции:

• агглютинации;
• преципитации;
• иммунофлюоресценции;
• иммуноферментный анализ и пр.

Также серологические анализы на сифилис подразделяют на трепонемные и нетрепонемные.

Нетрепонемные

При подозрении на приобретенный сифилис выполняют скрининговое тестирование, для чего используют нетрепонемные тесты , определяющие антитела к липоидным антигенам тканей хозяина или возбудителя в разнообразных модификациях. В РФ рутинно выполняют реакцию микропреципитации (РМП), которая позволяет выявить антитела к поврежденным патогеном клеткам в крови. Достоверность скрининга высокая, но специфичность невелика, поэтому тестирование подходит для первичного массового обследования в превентивных целях.

Чувствительность экспресс-тестов оценивается в 78-86% для выявления первичного сифилиса, 100% для вторичного сифилиса и 95-98% для выявления третичного сифилиса.

Специфичность - от 85-99%, иногда- менее, что встречается при следующих состояниях:

• гестация;
• менструация;
• онкология;
• заболевания соединительной ткани;
• вирусные заболевания;
• болезни печени;
• вакцинация;
• «свежий» ИМ;
• сыпной тиф и пр.

Помимо этого, избыток жиров в рационе, употребление спиртосодержащих напитков и прием некоторых лекарств могут привести к ложноложительным заключениям.

Результаты скринингового тестирования становятся положительными через 1-2 недели после образования шанкра. Нетрепонемные тесты дают отрицательный ответ через некоторое время после лечения. При ВИЧ-статусе нетрепонемные антитела могут выявляться длительно, иногда на протяжении всей жизни (что подтверждается результатами соответствующего рандомизированнного исследования).

Другие разновидности нетрепонемных анализов: VDRL, плазмореагиновый тест (RPR) , проба с толуидиновым красным, реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк).

Реакция Вассермана (RW)

Связывание комплемента – ответ иммунной системы на инфицирование, результат варьируется от отрицательного (ставится «-»), до резко положительного «++++» или 4 плюса.

В начальной стадии первичного сифилиса RW отрицательна.

Трепонемные

Из-за возможности ложноположительных результатов для подтверждения любого положительного или сомнительного результата нетрепонемного анализа, используют трепонемные тесты:

• реакция иммунофлюоресценции (РИФ);
• гемагглютинация (РПГА),
• иммуноферментный анализ (ИФА) для иммуноглобулинов класса G (IgG) и иммуноглобулина М (IgM);
• иммуноблоттинг;
• РИБТ/РИТ (реакция иммобилизации бледных трепонем).

Трепонемные тесты не используются для оценки эффективности терапии.

РИФ на определение трепонемных АТ класса IgG применяют после положительного результата экспресс-анализов (чувствительность 84% для первичного сифилиса и 100 % при других стадиях, специфичность 96%). Для диагностики у новорожденных не применимы.

В некоторых лабораториях используют «обратные» скрининговые исследования.

CDC (Centers for Disease Control and Prevention, США) рекомендует традиционные исследования, с проверкой количественными нетрепонемными тестами, при положительном результате проводится лечение.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

На собранный материал наносят сыворотку с мечеными флюорохромом антителами, специфичными к антигену бледной трепонемы, возбудитель притягивает к себе иммунные комплексы, из-за чего начинает светиться в люминесцентном микроскопе.

Реакция пассивной гемоагглютинации или РПГА

До появления гемагглютинации (склеивания) эритроцитов с момента внедрения бледной трепонемы должно пройти не менее 4 недель.

Подготовленные эритроциты с фиксированными белковыми фракциями патогена взаимодействуют с плазмой, если есть антитела к сифилису, происходит реакция.

Подходит для подтверждения любой стадии заболевания.

Иммуноферментный анализ

В основу положена реакция антиген-антитело. Выявляются антитела различных классов, которые можно оценить количественно.

Полученные результаты позволяют судить о длительности патологического процесса, успешности проводимого лечения, иммунологическом статусе, активности возбудителей.

Иммуноблоттинг – разновидность ИФА, применяют для углубленной диагностики при всех сомнительных результатах.

Чувствительность и специфичность близка к 100%, на сегодняшний день ультрачувствительный метод идентификации белков.

РИБТ

Способ основан на реакции антиген-антитело. Антигеном служат бледные трепонемы, культивируемые в тестикулах кролика. При взаимодействии с антителами зараженного человека, патогены утрачивают подвижность. Реакция оценивается с помощью микроскопии в темном поле.

Обратите внимание

РИБТ в настоящее время применяют из-за трудоемкости реже, но анализ может быть полезен для решения спорных вопросов (ложноположительные реакции на сифилис).

Дифференциальная диагностика

Наибольшую сложность представляет диагностика третичного сифилиса, что обуславливается симптомами со стороны сердечно-сосудистой и нервной системы, а также проявлениями со стороны кожного покрова.

Пациенты обязательно должны быть обследованы на , и .

Перечислим заболевания, с которыми проводят дифференциальную диагностику при сифилисе:

• дерматологические проявления ;
• генитальные бородавки ();
• донованоз;
• венерическая лимфогранулема;
• вирус ;
• фрамбезия.

С чего начинается диагностика сифилиса

Изначально проводится беседа с пациентом, во время которой уточняются детали: когда был подозрительный половой контакт и какие есть жалобы.

После сбора анамнеза переходят к физикальному осмотру, особое внимание уделяется области гениталий и ануса, слизистым оболочкам и лимфатическим узлам. Предварительный диагноз уже может быть установлен. Окончательная верификация происходит с помощью лабораторных анализов.

Если сказать просто о сложном, то одни анализы выявляют возбудителя сифилиса, а другие отражают реакцию организма на внедрение бледной трепонемы.

Для установки окончательного диагноза РПГА следует дополнить 1 трепонемным и 1 нетрепонемным анализом.

Диагностика сифилиса у беременных

Проводятся обязательное исследование на сифилис несколько раз в течение беременности.

Направление на анализ КСР выдается во время первого визита женщины в консультацию, и за время беременности трижды выполняется обследование. Пациентки из высокой группы риска с отягощенным анамнезом: , асоциальные, зависимые и пр. требуют особенно пристального внимания.

Если результаты анализа положительные, проводят более глубокую диагностику, и по показаниям назначают лечение, которое зависит от стадии и клинических проявлений.

Диагностика врожденного сифилиса

Большинство детей с рождаются у нелеченных матерей, либо получивших терапию слишком поздно.

Трепонемные тесты с использованием неонатальной сыворотки не рекомендуются из-за пассивного переноса антител IgG. Все дети, рожденные от матерей с сифилисом, должны обследоваться с помощью количественного нетрепонемного серологического теста (RPR или VDRL), выполненного с использованием сыворотки крови новорожденного.

Как трактовать результаты серологических исследований

Реакция микропреципитации, РИФ и РПГА отрицательны – норма, положительны – подтверждение сифилиса.

Реакция микропреципитации отрицательна, остальные положительны – сифилис в анамнезе после проведения специфической терапии, либо поздняя стадия.

Отрицательная РИФ при положительных РПГА и реакции микропреципитации – результат вызывает сомнения, повторная комплексная оценка.

Отрицательный результат РИФ и микропреципитации, но положительная РПГА – состояние после успешной антибиотикотерапии либо ложноположительный результат.

Положительная РИФ при отрицательных РПГА и реакции микропреципитации – ранняя стадия, проведенное лечение или недостоверность результата.

Положительная реакция микропреципитации, не подтвержденная ни РПГА, ни РИФ – отсутствие сифилиса.

Инструментальное исследование при сифилисе

Инструментальная диагностика проводится в зависимости от вовлеченности органов. Например, гранулематозное поражение печени можно увидеть при брюшной полости.

У пациентов с третичным сифилисом может показать дилатацию аорты. Линейная кальцификация по ходу аорты свидетельствует в пользу сифилитического аортита.

Предложена и разработана Кунсом (1942). При помощи меченных флуорохромом специфических иммуноглобулинов в испытуемом материале (мазки, тканевык среды) находят бактериальные, вирусные и др. антигенные субстанции. При соединении меченного антитела с микробным или др. антигеном образуется светящийся комплекс, просматриваемый в люминесцентном микроскопе.

Существует прямой и непрямой методы иммунофлуоресценции.

Прямой метод . Готовят из исследуемого материала мазок, на который наносят специфическую флуоресцирующую сыворотку, и после связывания антитела с антигеном излишек сыворотки отмывают, препарат просматривают в люминесцентном микроскопе.

Непрямой (двухступенчатый) метод. Приготовленный мазок сначала обрабатывают неокрашенной иммунной сывороткой к предполагаемому антигену. После связывания антигена с антителом на мазок наносят антивидовую флуоресцирующую сыворотку (антиглобулин) животного того вида, на которых получена неокрашенная иммунная сыворотка. В результате антивидовая флуоресцирующая сыворотка адсорбируется на комплексе антиген-антитело и комплекс в люминисцентном микроскопе светится салатно-зеленым светом (ФИТ) или красные (РСХ) – флуоресцеиниоизоционат и родаминасульфохлорид.

Существует непрямой метод с использованием антикомплементарной сыворотке.

В настоящее время все шире используется метод метки антител светорассеивающими ферментами (напр., пероксидаза хрена) – ИФА. Иммунные комплексы можно выявлять под обычным светопольным микроскопом.

3. Реакции антигена с сенсибилизированными лимфоцитами наз. клеточными. Наибольшее значение среди методов иммунодиагностики с использованием проявления клеточного иммунитета имеет аллергическая диагностика. Это диагностика инфекционных болезней с помощью реакций, выявляющих повышенную чувствительность клеток и тканей организма к специфическим инфекционным аллергенам. На введение аллергена (в кожу, под кожу, на слизистые оболочки) инфицированный организм отвечает аллергической реакцией, которая протекает как местное (гиперемия, отек, болезненность) или общее (угнетение, повышение температуры тела, учащение дыхания, нарушение сердечной деятельности) явление. В неинфицированном организме таких явлений при введении аллергена не наблюдают.

Практическая ценность аллергодиагностики заключается в высокой специфичности, в возможности прижизненной постановки диагноза, простоте выполнения, в способности выявлять больных при отсутствии клинических признаков.

Широко используются аллергические пробы при сапе, туберкулезе, бруцеллезе, паратуберкулезе, туляремии, эпизоотическом лимфангите, сибирской язве и др. При этом используют аллергены (вещества антигенной или гаптенной природы, обусловливающие аллергию). Аллергены выпускают корпускулярные (состоят из бактерий, находящихся во взвеси) и лизированные (экстракты бактериальных культур). Примеры:

Маллеин – стерильный фильтрат убитой нагреванием бульонной культуры возбудителя сапа, применяется нанесением на слизистую глаза или введением п\к.

ППД туберкулин для млекопитающих и ППД туберкулин для птиц, состоящие из лиофильно высушенных осажденных белков культурального фильтрата возбудителя туберкулеза бычьего и человеческого видов в первом случае. ППД туберкулин для птиц – аналог ППД туберкулина для млекопитающих, но готовится из штаммов возбудителя туберкулеза птиц. Применяют их в основном в\к.

Бруцеллин ВИЭВ – опалесцирующая жидкость, содержащая специфические вещества, извлеченные из бруцелл, вводят п\к и в\к.

Тулярин – представляющий взвесь туляремийных микробов на физиологическом растворе с добавлением 3% глицерина, выращенных на твердой питательной среде, убитых путем нагревания. Пробу с ним ставят как в\к, так и накожно (у людей).

Антраксин (представляет продукт гидролиза вакцинного штамма противосибиреязвенной вакцины СТИ-1.

Используются и другие феномены клеточного иммунитета. Напр., реакция бласттрансформации лейкоцитов (РБТЛ) – переход малых лимфоцитов в бластные формы, способные к пролиферации и дальнейшей дифференцировке наз. бласттрансформацией и сопровождается морфологическими изменениями лимфоцитов. Бласты – крупные, округлой формы клетки имеют большое ядро, занимающее большую часть цитоплазмы. В ядре содержится несколько крупных базофильных ядрышек, цитоплазма бластов зернистая. РБТЛ изучают в культуре лимфоцитов in vitro под влиянием антигена, к которым лимфоциты сенсибилизированы, прямым подсчетом бластов в окрашенных препаратах под микроскопом.

Реакция торможения миграции макрофагов – заключается в том, что лимфоциты сенсибилизированного организма в присутствии специфичесского антигена в культуральной среде продуцируют лимфокин – фактор, угнетающий миграцию макрофагов.

И другие (прочитаете сами): феномен розеткообразования, бляшкообразования.

Репродукция виру сов

Способ размножения вирусов также отличается от деления, почкования, спорообразования или полового процесса, кото­рые имеют место у одноклеточных организмов, у клеток мно­гоклеточных организмов и у последних в целом. Репродукция, пли репликация, как обычно обозначают размножение виру­сов, происходит дизъюнктивно (последний термин ныне чаще подразумевается, чем употребляется). Формирование вирионов происходит либо путем само сборки (упаковка вирусной нук­леиновой кислоты в белковый капсид и образование таким путем нуклеокапсида), либо с участием клетки (некоторые липидсодержащие фаги микоплазм), либо обоими способами (оболочечные вирусы). Конечно, противопоставление митотического деления клетки и репликации не абсолютно, так как способы репликации генетического материала клетки и ДНК-содержащих вирусов принципиально не отличаются, а если учесть, что и синтез генетического материала у РНК-содержащих вирусов также осуществляется по матричному типу, то относительным является противопоставление митоза и репли­кации всех вирусов. И, тем не менее, различия в способах раз­множения клеток и вирусов настолько существенны, что име­ет смысл делить весь живой мир на вирусы и невирусы.

К вирусам не применимы и многие другие понятия, являю­щиеся «атрибутами» организмов, и, прежде всего такие фун­даментальные понятия, как «особь», «популяция», «вид».

Принято трактовать понятие «вирион» как вирусный инди­видуум, хотя вирион является лишь определенной стадией жиз­ни вируса, и как раз той стадией, на которой вирус не прояв­ляет жизнедеятельности. Поэтому было даже предложено име­новать эту стадию существования вируса вироспорой. Между тем существует несколько групп вирусов, у которых геном не только фрагментарен (это имеет место и у клеток эукариотов, геном которых дискретен и существует в виде суммы хро­мосом), но и разные его фрагменты разобщены и находятся в различных частицах. Вирус проявляет инфекционные свой­ства лишь при попадании полного набора разноименных час­тиц, число которых у вирусов растений 2-4, а у некоторых вирусов насекомых до 28. Что же представляет собой вирус­ный индивидуум в этих случаях, когда даже понятие «вирион» не может быть применено?

Переходя к анализу активной жизнедеятельности вируса, которая целиком сводится к его репродукции, мы обнаружива­ем, что место проникшего в клетку вириона занимают либо голая нуклеиновая кислота его (например, у вируса полиомие­лита), либо нуклеопротеидный комплекс (например, у вируса гриппа), либо более сложные субвирионные структуры (например, у реовируса). Затем происходит синтез дочерних молекул вирусного генома. У многих ДНК-содержащих вирусов этот процесс не только сходен с синтезом клеточной ДНК хромо­сом, но и обеспечивается в значительной степени, а иногда почти полностью клеточными ферментами. Причем это имеет место не только при образовании простых и мелких вирусов (паповавирусы, парвовирусы), но и при синтезе сложных виру­сов с большим геномом (герпесвирусы, иридовирусы), у кото­рых некоторая доля синтезов ДНК катализируется собствен­ными ферментами. Образующиеся при этом репликативные интермедиаты вряд ли могут быть охарактеризованы как ви­русные индивидуумы: это матрицы, на которых синтезируются многочисленные копии дочерних геномов вируса. У вирусов с геномом в виде однонитевой РНК они либо информационно бессмысленны, т. е. не кодируют соответствующие вирусспецифические белки (вирусы с позитивной полярностью генома), либо, напротив, содержат гены для вирусных белков, так как вирионная РНК не обладает кодирующими свойствами.

Наряду с продуктивным циклом некоторые ДНК-содержащие вирусы (умеренные фаги, паповавирусы, вирус гепатита В и др.) могут вступать в интегративное взаимодействие с клеточным геномом, ковалентно встраиваясь в него и, превращаясь в группу клеточных генов, которые передаются клеткам – потомкам (у эукариотов) по законам Менделеева. В этом состоянии интегрированный вирусный геном, обозначаемый как провирус, фактически является группой клеточных генов. Если в провирусе произойдет мутация, делающая невозможным "вырезание" вирусного генома из клеточного, такой дефектный провирус может навсегда стать составной частью генома. Многие данные позволяют заключить, что геномы про- и эукариотов имеют в своем составе интегрированные гены или геномы в прошлом самостоятельных вирусов.

Существует большая группа РНК-содержащих ретровирусов, у которых на матрице их генома синтезируется комплиментарная ДНК. Она в виде двунитевой ДНК интегриру­ется (ковалентно встраивается) в клеточный геном и в этом виде является матрицей для синтеза дочерних молекул вирионной РНК и мРНК для синтеза вирусных белков. В обоих случаях (интеграбельные ДНК-содержащие вирусы, ретро-вирусы) образующийся такими путями провирус становится, группой клеточных генов.

Эти факты и примеры наглядно иллюстрируют положение о неприменимости понятия индивидуума к вирусам.

Столь же неприменяемым к вирусам является и понятие популяции, так как внутриклеточная стадия репродукции, а тем более интеграционные процессы нацело лишают смысла трак­товку репродуцирующегося вируса как популяции. К этому следует добавить данные о дефектных интерферирующих ча­стицах, «сопровождающих» почти каждую вирусную инфек­цию. Эти частицы представляют собой вирионы с неполным геномом, поэтому они не способны к репродукции. Тем не ме­нее, они играют важную биологическую роль, обеспечивая персистенцию вирусов в инфицированных организмах или в куль­турах тканей. Таким образом, вирусная «популяция» чаше всего представляет собой суммы полноценных вирионов и де­фектных образований, т. е. фактически мертвого материала. Такого рода «популяции», состоящие из живых и мертвых осо­бей, невозможно даже представить в мире организмов. В не­которых случаях сумма дефектных частиц с дефектами в разных участках генома может обеспечить развитие вирусной инфекции (феномен множественной реактивации).

Естественно, в случае, если нет особей, нет популяции, трудно ввести понятие вида. Этот вывод будет подкреплен да­лее соображениями о происхождении и эволюции вирусов. И, тем не менее, эти понятия нашли применение в вирусологии. Мы говорим о разных реально существующих популяциях ви­русов на уровне как инфицированных организмов, так и по­пуляций хозяев вирусов, а современная международно-признанная классификация вирусов основана на выделении ви­дов, родов и даже семейств и применении биноминальной но­менклатуры, которая принята для всех остальных представи­телей органического мира. И это не чистые забавы, а теоре­тически обоснованные и практически полезные методические подходы. К объяснению этих парадоксов мы еще вернемся.

Если вирусы не организмы, то чем же тогда они являются? Для того чтобы ответить на этот вопрос, необходимо очертить круг биологических структур, которые можно обозначить как вирусы. Это легко, если речь идет об обычных, общепризнан­ных вирусах, например, о вирусах оспы или фаге MS2, не­смотря на то, что первый из них имеет геном - ДНК с моле­кулярной массой до 240·10 6 , а второй - РНК с молекулярной массой около 1,2·10 6 . Различия между этими вирусами, веро­ятно, не менее значимы, чем, скажем, между кишечной палоч­кой и слоном или хотя бы любой клеткой этого животного. Однако мир вирусов еще более богат, если не ограничивать их общепризнанными инфекционными вирусами.

К числу вирусов, несомненно, следует отнести и дефектные вирусы. Дефектными являются многие онкогенные ретровирусы, так как приобретение ими генов, кодирующих онкогены, часто сопровождается делениями остальных генов. В присут­ствии полноценных вирусов-помощников, обычно близких к дефектным биологически, дефектный вирус может либо реплицироваться (если он не имеет дефект гена полимеразы), либо использовать белки вируса-помощника (если он имеет дефек­ты генов внутренних или оболочечных белков). Возможно, ис­пользование и белков биологически отдаленных вирусов: если дефектный, по оболочечным белкам, ретровирус размножать в присутствии вируса везикулярного стоматита, то вирионы бу­дут иметь внешнюю оболочку последнего. Впрочем, для этого даже не надо, чтобы один из вирусов был дефектным: при сме­шанной инфекции многими вирусами образуются вирионы, ге­ном которых заключен в оболочки другого вируса.

С сателлитами «сближаются» плазмиды, или, как раньше их называли, эписомы, экстрахромосомные факторы наслед­ственности. Это относительно небольшие, обычно с молеку­лярной массой менее 10 7 , циркулярные, реже линейные, молекулы ДНК, которые часто обнаруживаются в бактериаль­ных клетках. Они выполняют разные функции соответственно имеющимся на них генам: токсины, убивающие насекомых; гены, обусловливающие опухолевые разрастания у растений; ферменты, разрушающие или модифицирующие антибиотики; фактор фертильности - фактически индуцирующий половой процесс у бактерий - обмен генами между хромосомами двух бактерий. У дрожжей обнаружены киллеры (двунитевая РНК), на которых «закодированы» токсины, убивающие дрожжевые клетки, не носящие в себе киллеров. От вирусов, в том числе дефектных, и сателлитов плазмиды имеют два главных отли­чия: их гены не кодируют синтез белков, в которые упакованы нуклеиновые кислоты, и репликация их обеспечивается клет­кой. Плазмиды обычно находятся в свободном виде в цито­плазме, но могут быть интегрированы в геном клетки-носите­ля, последняя может и освобождаться от них. Между плазмидами и обычными вирусами нет резких границ. Так, некоторые плазмиды явно являются производными фагов, утратив боль­шую часть их генов и сохранив лишь некоторые из них. Ряд вирусов, например, вирус папилломы коров, может длительно персистировать в виде плазмид - голых молекул ДНК. В виде плазмид с полным или частично делетированным геномом мо­гут персистировать вирусы герпеса. С развитием генной инженерии стали возможными искусственное получение плазмид из вирусной ДНК, встройка в плазмиды чужеродных генов и даже искусственное конструирование плазмид из фрагментов клеточной ДНК.

К вирусам примыкают вироиды - возбудители инфекцион­ных болезней растений. Они не имеют существенных отличии от обычных вирусных болезней, но вызываются своеобразными структурами - небольшими (молекулярная масса 120000- 160000) циркулярными суперспирализированными молекула­ми РНК. Во всем остальном это типичные вирусные болезни с определенными проявлениями, инфекционностью при меха­нической передаче, размножением вироидов в зараженных клетках.

Наконец, с вирусными инфекциями имеют сходство болез­ни животных (овцы, козы) и человека (болезнь куру, болезнь, Крейтцфельда - Якоба), выражающиеся в развитии спонги-формных энцефалопатий. Предполагают, что эти болезни являются результатами выхода из-под контроля генов, кодирую­щих белки, которые являются и их продуктами, и их деренрессорами, и причиной характерных поражений нервных клеток.

Возможность дегенеративной эволюции была неоднократно установлена и доказана, и, пожалуй, наиболее ярким примером ее может служить происхождение некоторых клеточных органелл эукариотов от симбиотических бактерий. В настоящее время на основании изучения гомологии нуклеиновых кислот можно считать установленным, что хлоропласты простейших и растений происходят от предков нынешних сине-зеленых бактерий, а митохондрии – от предков пурпурных бактерий. Обсуждается так же возможность происхождения центриолей от прокариотических симбионов. Поэтому такая возможность не исключена и для происхождения вирусов, особенно таких крупных, сложных и автономных, каким является вирус оспы.

Все же мир вирусов слишком разнообразен, чтобы при­знать возможность столь глубокой дегенеративной эволюции для большинства его представителей, от вирусов оспы, герпе­са и иридовирусов до аденосателлитов, от реовирусов до са­теллитов вируса некроза табака или РНК-содержащего дель­та-вируса - сателлита вируса гепатита В, не говоря уж о та­ких автономных генетических структурах, как плазмиды или вироиды. Разнообразие генетического материала у вирусов является одним из аргументов в пользу происхождения виру­сов от доклеточных форм. Действительно, генетический мате­риал вирусов «исчерпывает» все его возможные формы: одно- и двунитевые РНК и ДНК, их линейные, циркулярные и фраг­ментарные виды. Природа как - бы испробовала на вирусах все возможные варианты генетического материала, прежде чем окончательно остановила свой выбор на канонических его формах -двунитевой ДНК как хранителе генетической ин­формации и однонитевой РНК как ее передатчике. И все же разнообразие генетического материала у вирусов скорее сви­детельствует о полифилетическом происхождении вирусов, не­жели о сохранении предковых доклеточных форм, геном которых эволюционировал по маловероятному пути от РНК к ДНК, от однонитевых форм к двунитевым и т. п.

Третья гипотеза 20-30 лет казалась маловероятной и даже получила ироническое название гипотезы взбесившихся ге­нов. Однако накопленные факты дают все новые и новые аргу­менты в пользу этой гипотезы. Ряд этих фактов будет обсуж­ден в специальной части книги. Здесь же отметим, что именно эта гипотеза легко объясняет не только вполне очевидное полифилетическое происхождение вирусов, но и общность столь разнообразных структур, какими являются полноценные и де­фектные вирусы, сателлиты и плазмиды и даже прионы. Из этой концепции также вытекает, что образование вирусов не явилось единовременным событием, а происходило много­кратно и продолжает происходить в настоящее время. Уже в далёкие времена, когда начали формироваться клеточные фор­мы, наряду и вместе с ними сохранились и развивались не­клеточные формы, представленные вирусами - автономными, но клеточно-зависимыми генетическими структурами. Ныне существующие вирусы являются продуктами эволюции, как древнейших их предков, так и недавно возникших автономных генетических структур. Вероятно, хвостатые фаги служат при­мером первых, в то время как R-плазмиды - примером вторых.

Основным положением эволюционной теории Ч. Дарвина является признание борьбы за существование и естественного отбора как движущих сил эволюционного процесса. Открытия Г. Менделя и последующее развитие генетики дополнили ос­новные положения эволюционной теории учением о наслед­ственной изменчивости, имеющей случайный, стохастический, характер, в частности о мутациях и рекомбинациях, которые являются «материалом» для естественного отбора. Последую­щее развитие молекулярной генетики материализировало по­нятие гена и химических основ мутаций и рекомбинаций, включая точечные мутации, вставки, делеции, перестройку и т. п. Однако справедливо отмечалось, что молекулярная ге­нетика хорошо объясняла лишь процессы микроэволюции преимущественно в пределах мира и плохо объясняла про­цессы макроэволюции - образование крупных таксономичес­ких групп, являющихся основой прогрессивной эволюции.

Для объяснения молекулярных основ этих процессов, а так­же реальных темпов эволюции была предложена теория дупликации генов и геномов . Эта концепция со­ответствует наблюдаемым фактам и хорошо объясняет эво­люцию органического мира на Земле, в частности, появление позвоночных (хордовых) и их дальнейшую эволюцию от при­митивных бесчерепных до человека. Поэтому эта концепция быстро получила признание среди биологов, изучающих моле­кулярные основы эволюции.

Наряду с этим накопилось значительное число фактов, сви­детельствующих о существовании в природе в широких мас­штабах обмена готовыми блоками генетической информации, в том числе у представителей разных, эволюционно далеких вирусов. В результате такого обмена могут быстро и скачко­образно изменяться наследственные свойства путем встраива­ния чужеродных генов (заимствование генной функции). Но­вые генетические качества могут возникнуть также благода­ря неожиданному сочетанию собственных и интегрированных генов (возникновение новой функции). Наконец, простое уве­личение генома за счет неработающих генов открывает воз­можность эволюции последних (образование новых генов).

Особая роль в обеспечении этих процессов принадлежит вирусам - автономным генетическим структурам, включающим как конвенционные вирусы, так и плазмиды. Эта мысль была вы­сказана в общих чертах , а затем развита более подробно [Жданов В. М., Тихоненко Т. И., 1974].

Репродукция ДНК-вирусов. Репликативный цикл ДНК-содержащих вирусов. Репродукция паповавирусов. Репродукция аденовирусов.

Вирусы, лишённые суперкапсида (например, аденовирусы) проникают в клетки путём виропексиса, а имеющие таковой (покс- и герпесвирусы) - за счёт слияния суперкапсида с клеточной мембраной. Репродуктивный цикл ДНК-содержащих вирусов включает раннюю и позднюю стадии (рис. 5-4). У крупных ДНК-вирусов имеется явное несоответствие между кодирующе ёмкостью генома и молекулярной массой вирусиндуцированных белков и белков, входящих состав вирионов. Например, у герпесвирусов лишь 15% ДНК кодирует все белки вирионов и их предшественников. Возможно, значительная часть генома содержит гены, кодирующие синтез ферментов и регуляторных белков. Папова-, адено- и герпесвирусы репродуцируются относительно однотипно, в то время как репродукция поксвирусов имеет некоторые особенности.

Ранняя стадия репродукции . Вирусная ДНК проникает в ядро клетки, где транскрибируется клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразой. При этом считываетеся, а затем транслируется часть вирусного генома («paнние гены»). В результате синтезируются «ранние белки» (регуляторные и матричные белки вирусные полимеразы).

Регуляторные белки выполняют различные функции. При заражении клетки они блокируют синтез клеточных РНК, ДНК и белка и одновременно способствуют экспрессии вирусного генома, изменяя специфичность реагирования клеточных полимераз и полирибосом. Они так же запускают репликацию клеточной ДНК, модифицированной встроенными геномами ДНК содержащих вирусов и ретровирусов, то есть репликацию вирусных геномов. Вирусспецифические полимеразы. В репликацию вирусных геномов также вовлечены вирусоспецифические ДНК-полимеразы, участвующие в образовании молекул ДНК дочерних популяций.

Матричные белки необходимы для репликации нуклеиновых кислот и сборки дочерних популяций. Они образуют электронно-плотные скопления в клетке, известные как тельца включений (например, тельца Гварнери при натуральной оспе).

Поздняя стадия репродукции . На этом этапе происходит синтез нуклеиновых кислот вируса. Не вся вновь синтезированная вирусная ДНК упаковывается в вирионы дочерней популяции. Часть ДНК («поздние гены») используется для синтеза «поздних белков», необходимых для сборки вирионов. Их образование катализируют вирусные и модифицированные клеточные полимеразы.

Паповавирусы и аденовирусы. Репродукция паповавирусов. Репродукция аденовирусов.

Адсорбция , проникновение и депротеинизация аналогичны таковым у РНК-содержащих вирусов, но у папова - и аденовирусов депротеинизация протекает в ядре, а у РНК-вирусов - в цитоплазме.

Ранняя фаза репродукции . Вирусная ДНК («ранние гены») транскрибируется в ядре клетки. На одной из нитей ДНК реализуется транскрипция вирусной «ранней» мРНК. Механизмы транскрипции вирусной ДНК аналогичны считыванию информации с клеточной ДНК. Специфическая мРНК транслируется, начинается синтез ферментов, необходимых для образования дочерних копий ДНК. Синтез клеточной ДНК может временно усиливаться, но затем обязательно подавляется регуляторными белками вируса.

Поздняя фаза репродукции . В течение поздней фазы дочерняя вирусная ДНК продолжает активно транскрибироваться клеточными РНК-полимеразами, в результате чего появляются продукты поздних вирусспецифических синтезов. «Поздняя» мРНК мигрирует в цитоплазму и транслируется на рибосомах. В результате синтезируются капсидные белки дочерней популяции, которые транспортируются в ядро и собираются вокруг молекул дочерней ДНК новых вирусных частиц. Выход полных дочерних популяций сопровождается гибелью клетки.

начальный период включает стадии адсорбции вируса на клетке, проникновения в клетку, дезинтеграции (депротеинизации) или "раздевания" вируса. Вирусная нуклеиновая кислота была доставлена в соответствующие клеточные структуры и под действием лизосомальных ферментов клетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникальная биологическая структура: инфицированная клетка содержит 2 генома (собственный и вирусный) и 1 синтетический аппарат (клеточный);

После этого начинается вторая группа процессов репродукции вируса, включающая средний и заключительный периоды, во время которых происходят репрессия клеточного и экспрессия вирусного генома. Репрессию клеточного генома обеспечивают низкомолекулярные регуляторные белки типа гистонов, синтезируемые в любой клетке. При вирусной инфекции этот процесс усиливается, теперь клетка представляет собой структуру, в которой генетический аппарат представлен вирусным геномом, а синтетический аппарат - синтетическими системами клетки.

2. Дальнейшее течение событий в клетке направлено на репликацию вирусной нуклеиновой кислоты (синтез генетического материала для новых вирионов) и реализацию содержащейся в ней генетической информации (синтез белковых компонентов для новых вирионов). У ДНК-содержащих вирусов, как в прокариотиче-ских, так и в эукариотических клетках, репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. При этом у однонитевых ДНК-содержащих вирусов сначала образуется комплементарная нить - так называемая репликативная форма, которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК.

3. Реализация генетической информации вируса, содержащейся в ДНК, происходит следующим образом: при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые поступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусспе-цифические белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина, это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу.

У РНК-содержащих вирусов процессы репликации их генома, транскрипции и трансляции генетической информации осуществляются иными путями. Репликация вирусных РНК, как минус-, так и плюс-нитей, осуществляется через репликативную форму РНК (комплементарную исходной), синтез которой обеспечивает РНК-зависимая РНК-полимераза - это геномный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Репликативная форма РНК минус-нитевых вирусов (плюс-нить) служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул вирусной РНК (минус-нитей), но и выполняет функции и-РНК, т. е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков (трансляцию).

У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз.

У некоторых РНК-содержащих вирусов (реовирусы) имеется совершенно уникальный механизм транскрипции. Он обеспечивается специфическим вирусным ферментом - ревертазой (обратной транскриптазой) и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что вначале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется,вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С него обычным путем через образование и-РНК происходит реализация информации вирусного генома.

Результатом описанных процессов репликации, транскрипции и трансляции является образование дочерних молекул вирусной нуклеиновой кислоты и вирусных белков, закодированных в геноме вируса.

После этого наступает третий, заключительный период взаимодействия вируса и клетки. Из структурных компонентов (нуклеиновых кислот и белков) на мембранах цитоплазматического ретикулума клетки собираются новые вирионы. Клетка, геном которой был репрессирован (подавлен), обычно гибнет. Вновь сформировавшиеся вирионы пассивно (в результате гибели клетки) или активно (путем почкования) покидают клетку и оказываются в окружающей ее среде.

Таким образом, синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков и сборка новых вирионов происходят в определенной последовательности (разобщены во времени) и в разных структурах клетки (разобщен в пространстве), в связи с чем способ репродукции вирусов и был назван дизъюнктивным (разобщенным). При абортивной вирусной инфекции процесс взаимодействия вируса с клеткой по тем или иным причинам прерывается до того, как произошло подавление клеточного генома. Очевидно, что в этом случае генетическая информация вируса реализована не будет и репродукции вируса не происходит, а клетка сохраняет свои функции неизменными.

При латентной вирусной инфекции в клетке одновременно функционируют оба генома, а при вирус-индуцированных трансформациях вирусный геном становится частью клеточного, функционирует и наследуется вместе с ним.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ). Обязательным условием является исключение перед обследованием приема больным антибиотиков, которые оказывают токсическое действие на бледные трепонемы, вызывая их неспецифическое обездвижение.

Положительные результаты РИБТ обнаруживаются примерно с середины вторичного свежего периода сифилиса, и могут длительно сохраняться после проведенного лечения. При необходимости метод используют для выявления АТ в СМЖ, это исследование отличает высокая специфичность, но низкая чувствительность (около 40 %).

РИБТ мало пригодна для диагностики ранних форм сифилиса ввиду позднего (не ранее 8–9 недель от момента заражения) появления АТ-иммобилизинов; метод может давать ложноположительные результаты, в особенности у больных с аутоиммунной патологией, злокачественными заболеваниями, диабетом. Кроме того, РИБТ – достаточно сложный, трудоемкий и дорогостоящий анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария, в связи с чем в последние годы он используется лишь в отдельных лабораториях. В диагностике РИБТ применяется как реакция-арбитр при расхождении результатов других серологических исследований, для дифференцирования ложноположительных результатов и при установлении диагноза поздних форм сифилиса.

Реакция связывания комплемента с трепонемным антигеном (РСК с ТА) .Чувствительность метода – около 80 %, специфичность – 98 %. Метод входил в состав комплекса стандартных серологических реакций на сифилис, регламентированного приказом Минздрава СССР № 1161 от 02.09.1985 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса». В настоящее время использование этой реакции, как и РСК с кардиолипиновым антигеном, ограничено отдельными лабораториями.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) . Для диагностики сифилиса используют несколько модификаций РИФ: РИФ-ц – для выявления АТ в СМЖ, РИФ-200 (тестируемую сыворотку перед реакцией разводят в 200 раз); РИФ-абс (РИФ с абсорбцией), IgM-РИФ-абс (для определения АТ IgM). По чувствительности и специфичности РИФ-абс не уступает РИБТ, но выполнение этого метода намного проще. Результаты РИФ-абс становятся положительными с 3–й недели после заражения (до появления твердого шанкра или одновременно с ним), это метод ранней диагностики сифилиса. Нередки положительные результаты исследования спустя много лет после полноценного лечения раннего сифилиса, а у больных с поздним сифилисом – на протяжении десятилетий.

Показания для выполнения РИФ-абс:

• положительные результаты НТТ у беременных при отсутствии клинических и анамнестических данных, свидетельствующих о сифилисе;
• обследование лиц с различными соматическими и инфекционными заболеваниями, при которых отмечают положительные результаты НТТ;
• обследование лиц с клиническими проявлениями, характерными для сифилиса, но с отрицательными результатами НТТ;
• ранняя диагностика сифилиса;
• в части случаев – как критерий успешности противосифилитического лечения: переход положительной РИФ-абс в отрицательную после лечения является 100% критерием излеченности сифилиса.

IgM–РИФ–абс применяют для раздельного выявления АТ классов Ig, что представляет особый интерес при диагностике врожденного сифилиса, когда АТ к трепонеме, синтезированные в организме ребенка, представлены IgM, а АТ IgG имеют материнское происхождение. Показаниями к проведению этого исследования являются: диагностика врожденного сифилиса; оценка результатов лечения раннего сифилиса.

РИФ обладает высокой чувствительностью (98,5%) и специфичностью (99,6%) практически при всех формах сифилиса. Недостатками РИФ являются: невозможность автоматизации исследования и учета результатов; трудности приготовления качественного антигена из взвеси бледных трепонем, полученных из яичка зараженного кролика; субъективизм в оценке результатов.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) . Сопоставление результатов, полученных при использовании РПГА и РИБТ, РИФ–абс, КСР, МРП показало высокую чувствительность и специфичность РПГА при диагностике сифилиса, совпадающую с результатами РИФ–абс.

РПГА может быть выполнена в качественном и количественном вариантах, существуют их макро- и микромодификации. Количественный метод РПГА позволяет оценить концентрацию специфических трепонемных АТ в крови. Титры от 1: 640 и ниже характерны для пациентов, леченных по поводу сифилиса в прошлом. Более высокие титры – обычно для активной нелеченной инфекции.

Положительные результаты РПГА, как правило, отмечают спустя 3 недели после появления твердого шанкра и далее у пациентов, перенесших сифилис, в течение многих лет, нередко пожизненно.

Чувствительность РПГА составляет 76% при первичном сифилисе; 100% при вторичном сифилисе; 97% при скрытом сифилисе; 94% при позднем сифилисе. Специфичность РПГА выше, чем специфичность РИФ–абс, составляет 99%.

Благодаря соотношению высокой специфичности, чувствительности, простоты выполнения, стандартизации реагентов среди трепонемных тестов для серодиагностики сифилиса РПГА стабильно занимает лидирующее место в клинической практике в мире.

Особые преимущества ИФА заключаются: в высокой чувствительности и специфичности метода; автоматизации постановки реакции; высокой степени стандартизации; возможности исследования большого количества образцов сывороток; в количественном учете и объективной документации полученных результатов; возможности одновременного определения титра противотрепонемных АТ разных классов (IgG и IgM) в одном образце; пригодности для ранней диагностики сифилиса и диагностики врожденного сифилиса; в удобстве применения для тестирования крови в службе переливания крови; применимости в качестве подтверждающего специфического трепонемного теста. Чувствительность ИФА 98–100%, специфичность 96–100%.

К недостаткам ИФА можно отнести: непригодность для исследования единичных образцов; более длительный срок до получения результата, и меньший срок годности ИФА-наборов, например, по сравнению с РПГА.

Иммунный блот (ИБ). Одним из современных методов диагностики сифилиса является ИБ для определения АТ IgG либо IgM к определенным АГ бледной трепонемы.

Метод обладает высокой чувствительностью (до 100%,), специфичностью (98%) и воспроизводимостью (100%). Исследование дает возможность изучения спектра АТ сразу к нескольким АГ T.pallidum, применения высокоочищенных рекомбинантных и пептидных АГ, снижающих до минимума неспецифическую реактивность сывороток.

Все это определяет возможность предпочтения применения метода ИБ перед другими трепонемными тестами для верификации диагноза сифилиса в сложных случаях, в частности, для диагностики сифилиса во второй половине инкубационного периода, скрытого врожденного сифилиса в первые дни жизни ребенка, для выявления скрытого сифилиса у лиц со слабым гуморальным ответом, а также для дифференцирования ложноположительных результатов других тестов.

Впервые предложена Coombs в 1942 г. РИФ основана на выявлении антигенов в клиническом материале, препаратах клеток крови и др. с помощью моноклональных антител или сывороток, меченных флуорохромом (прямая РИФ). Первые (диагностические) антитела можно выявлять антииммуноглобулиновой сывороткой, меченной флуорохромами (непрямая РИФ). Существуют модификации РИФ для выявления антител к инфекционным агентам в сыворотке крови или антител в сыворотке крови.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Сегодня в этой реакции используются как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела, меченные флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для уменьшения неспецифического свечения фона применяют обработку препаратов бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином или синькой Эванса.

Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональые антитела (в случае непрямой РИФ препарат сначала обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.

При постановке РИФ для обнаружения антител готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.

Основным недостатком РИФ является ее субъективность.

Классическими критериями специфичности этой реакции являются:

· характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;

· периферический характер свечения объекта;

· цвет флюоресценции;

· интенсивность флюоресценции.

При исследовании крупных объектов (трихомонады, клетки человека, клетки пораженные бактериями или вирусами) эти критерии позволяют получить достоверный результат. В то же время, элементарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вышесказанным, субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалификации персонала, проводящего исследования.

2.2. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (ФИА ВР, Etkins R. et Wallac O., 1984)

Эта разновидность ФИА основана на принципах сорбции одного из реагентов на твердой фазе и применении технологии «сэндвича», т.е. двойного распознавания, подобно тИФА. Однако важным отличием метода является применение в качестве метки хелатов лантаноидов (редкоземельных элементов европия, самария, тербия и диспрозия). Преимущества ФИА ВР – это высокая чувствительность, технология постановки, подобная ИФА, и потенциальная возможность значительного усиления полезного сигнала вследствие весьма высокого отношения сигнал/шум. Специфическая флуоресцентная метка флуоресцирует неизмеримо сильнее и дольше, чем фоновая флуоресценция. Кроме того, метка обладает способностью восстанавливать способность к свечению (для учета применяют импульсное возбуждающее излучение с периодом в 1с - более 1000 импульсов), что приводит к накоплению (усилению) полезного сигнала. Описываемая система реализована фирмой PerkinElmer, США, под названием Delfia и обладает чувствительностью более 10 -17 М при определении антигенов.

2.3. Проточная цитофлуориметрия

В настоящее время широко применяются серологические реакции, в которых участвуют меченые АГ-ы или АТ-ла. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы.

Они применяются:

1)для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъю-гированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями) антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченых диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ-м, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.

Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.

Нет сходных материалов

В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:

1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);

2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;

3) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.

Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию - свечение.

Компоненты непрямой РИФ:

1) исследуемый материал;

2) специфическая антисыворотка;

3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;

4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем - меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ - меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.

Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ - меченые - АТ-комплемент.

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом (рис. 7). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериальных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой метод.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В, у больных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1-2 сут при температуре 40 ° С, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом 125 J) и продолжают инкубацию еще 24 часа. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 8). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, последние не вступают в связь с меченным антигеном и, поэтому, он не обнаруживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и известного количества меченного антигена с активными центрами антител.В качестве метки используются радиоактивные изотопы.

В зависимости от техники постановки выделяют два способа РИА.

1) Техника «жидкая фаза» (классический РИА). Недостаток этой техники постановки - необходимость

специального разделения свободного и связанного меченого антигенов (или антител).

2) Техника «твёрдая фаза».

АГ или АТ известной специфичности связываются на сорбентах (твёрдой фазе) - стенках полистироловой лунки или пластиковой пробирки. На иммобилизованный АГ (АТ) последо-ватепьно сорбируются остальные компоненты ИК.

В зависимости от характера реакции различают следующие методы:

1) Конкурентный метод - метод, основанный на конкуренции АГ.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ (исследуемый материал - кровь, мокрота и др.);

б) идентичный к исследуемому АГ-у антиген, меченый радиоизотопом;

в) специфические АТ-ла известной концентрации, связанные на сорбенте;

г) стандартный АГ (контрольный);

д) буферный раствор.

Сначала в реакцию вводят исследуемый АГ. Происходит образование комплекса АГ-АТ на поверхности сорбента. Сорбент отмывают, затем вводят меченый АГ, Чем больше содержание исследуемого АГ, тем меньше меченого АГ связывается с АТ-м на поверхности сорбента. Концентрацию меченого АГ определяют измерением радиоактивности реакции с помощью счетчиков. Величина радиоактивности реакции будет обратно пропорциональной количеству АГ в исследуемой пробе.

2) Неконкурентный метод.

Компоненты реакции:

а) определяемый АГ;

б) специфический АТ-а известной концентрации, связан-

ные на сорбенте;

в) идентичные к связанному антителу антитела, меченые

радиоизотопом;

г) стандартный АГ;

д) буферный раствор.

К связанным АТ добавляют исследуемый АГ. В процессе инкубации на сорбенте образуются комплексы АГ-АТ. Сорбент отмывают от свободных компонентов и добавляют меченые АТ, которые связываются со свободными валентностями АГ-на в составе комплекса. Величина радиоактивности пропорциональна концентрации исследуемого АГ.

3) «Сэндвич-метод» (непрямой метод) - наиболее распространённый метод.

Компоненты:

а) исследуемая сыворотка (или исследуемый АГ);

б) АГ-ы, связанные на сорбенте (или АТ-ла, связанные на сорбенте при определении АГ-а);

в) диагностические АТ против иммуноглобулинов, меченые радиоизотопами;

г) контрольные сыворотки (или АГ-ы);

д) буферные растворы.

Исследуемые АТ-а (или АГ-ы) реагируют с твердофазными АГ-ми (АТ-ми), после чего инкубат удаляется и в реакцию вводят меченые антиглобулиновые АТ, которые связываются со специфическими комплексами АГ-АТ на поверхности сорбента. Величина радиоактивности реакции прямо пропорциональна количеству исследуемого АТ (или АГ).

Достоинства РИА:

1) высокая специфичность и чувствительность;

2) простота техники постановки;

3) точность количественной оценки результатов;

4) легко поддаётся автоматизации.

Недостаток: использование радиоактивных изотопов.

Нет сходных материалов(

Иммуноферментный метод (ИФА)

Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, b - галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 9).

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используются микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а за тем - смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидаза является раствор ортофенилдиамина.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. Сущность ИФА аналогична РИА.

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

Отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

Простота методов оценки реакции;

Стабильность конъюгатов;

Легко поддаётся автоматизации.

Однако, по сравнению с РИА, отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

Конкурентный тип.

Назначение.

Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.

Компоненты:

1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;

2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;

3) коньюгат - мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,

4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

Положительная (сыворотка с НВе Ад);

Отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы

1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2) Инкубация 1 час при 37 «С.

3) Отмывание лунок.

4) Внесение конъюгата.

5) Инкубация 1 час при 37 «С.

6) Отмывание лунок.

7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.

Механизм

Реакция протекает в три фазы:

1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад - агл\ НВз АТ).

2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).

3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.

Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции - обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:

1) исследуемый материал - сыворотка крови;

2) синтетические